Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2

Prostatakrebs Teil 3 - PSA-Rezidiv - Was nun?

Russland Sanatorium Behandlung von Prostatitis

Manual zz. Jürgen Wolfrum Prof. Sensitive Nachweismethoden für proteolytische Aktivität tragen zu einem tiefergehenden Verständnis der bei der Entstehung von Tochtergeschwüren beteiligten proteolytischen Prozesse bei und ebnen somit den Weg zur Entwicklung effektiver Antitumormedikamente. Unter Verwendung modifizierter natürlicher Proteine als Proteasesubstrate konnten zwei einzelmolekülspektroskopiebasierte Detektionsmethoden erarbeitet werden, welche einen sensitiven Nachweis proteolytischer Aktivität erlauben.

Während sich das eine Verfahren der Detektion zeitlich korrelierter Fluoreszenzsignale bedient siehe Schema Inutzt das andere funktionalisierte Oberflächen zur Erkennung der Proteaseaktivität. Darüber hinaus gelang die Weiterentwicklung des Smart Probe-basierten Nachweisverfahrens zur sensitiven und spezifischen Diskriminierung von DNA-Punktmutationen durch den Einsatz von Oligonukleotiden, die zur Sonde bei der Anbindung an die Wildtypsequenzen in Konkurrenz stehen.

Auf Grundlage der in diesen Arbeiten gesammelten Erfahrungen konnte zusätzlich eine neuartige, auf den speziellen Emissionseigenschaften des Coumarinfarbstoffs DyXL beruhende DNA-Sonde konzipiert werden, welche ebenfalls eine eindeutige und einfache Diskriminierung von Punktmutationen mit hoher Sensitivität erlaubt.

Many proteases play key roles in metastatic processes, the major challenge for cancer treatment. Sensitive detection methods for proteolytic activity contribute to a more profound understanding of proteolytic processes involved in the development of metastasis and facilitate the development of effective anti-tumor drugs. Using modified natural proteins as protease substrates, two methods based on single-molecule spectroscopy which enable the Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 detection of proteolytic activity were established.

While the first assay deals with the recognition of time-correlated fluores- cence signals scheme Ithe second one uses functionalized fluorescence-based surfaces for the identification of protease activity.

A new protein labeling method was established in order to Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 Scheme I: Mechanism of the protease assay substrates fluorescently in a stoichiometric based on the recognition of signal manner while preserving native protein correlations.

Furthermore, the Smart Probe-based assay for detecting single nucleotide polymorphisms was successfully enhanced in this work, using Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 that compete with the Smart Probe in binding to target sequences which contain mismatches.

This modification enables the specific and sensitive recognition of single nucleotide polymorphisms. Based on Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 findings of the presented work, a novel DNA-Probe was designed using the special properties of the Coumarin dye DyXL, allowing a specific and simple discrimination of single nucleotide polymorphisms with high sensitivity.

Die klinischen Studien mit Breitbandproteaseinhibitoren verliefen jedoch mehr als enttäuschend. Es stellte sich in Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 vergangenen Jahren Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 deutlicher heraus, Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 die proteolytischen Enzyme in vielfältiger Weise untereinander sowie mit Signalkaskaden wechselwirken und in verschiedenen Tumorstadien unterschiedliche Wirkungen entfalten.

Daher ist vor weiteren Versuchen, Proteasen als Wirkstoffziele zur Tumorbekämpfung zu verwenden, ein grundlegendes Verständnis der proteolytischen Abläufe von Nöten. Dies kann mit den bisherigen Proteasetestsystemen nur bis zu einem gewissen Grad erreicht werden, da die hierbei verwendeten kurzen synthetischen Peptidsubstrate keine Tertiärstrukturen aufweisen und somit eine Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die in vivo-Proteasesubstrate schwierig ist.

Aufgrund dessen war es Ziel Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 vorliegenden Arbeit, ein sensitives Nachweissystem für proteolytische Aktivität zu etablieren, welches sich natürlicher Proteine als Proteasesubstrate bedient. Im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen hochgradig markierten Proteinen sollten die hier eingesetzten lediglich mit einem Fluorophor modifiziert sein. Hierzu musste zunächst ein Verfahren entwickelt werden, natürliche Proteine unter Erhalt ihrer biologischen Funktionalität stöchiometrisch zu markieren.

Somit konnte man anhand dieses DNA-Codes aus dem Reaktionsgemisch über eine mit komplementärem Oligonukleotid funktionalisierte Festphase selektiv die modifizierten Proteine isolieren. Eine Variation der Basenabfolge des Oligonukleotids ermöglichte ferner erstmals die parallele oder sequentielle Einführung mehrerer Markierungen unabhängig voneinander mit derselben Methode. Ein weiterer Vorteil der Methode besteht darin, dass sie ohne teure Geräte, wie beispielsweise HPLC, auskommt und somit in jedem Labor direkt praktiziert werden kann.

Unter Verwendung der damit erhaltenen Proteasesubstrate konnten im Anschluss zwei alternative einzelmolekülspektroskopische Verfahren zur Detektion Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 Aktivität etabliert werden. Dieses Prinzip konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals mit zwei konventionellen organischen Fluorophoren auf Einzelmolekülebene realisiert werden.

Der Nachweis proteolytischer Aktivität der Substrate erfolgte über die entsprechend sinkende Zahl zeitlich korrelierter Fluoreszenzereignisse von A und DyXL, welche durch den Verdau voneinander separiert wurden und somit unabhängig diffundierten siehe Abbildung I.

Erst die Verwendung der Einzelmolekülspektroskopie ermöglichte diese Art der Detektion, da hierfür die Fluoreszenzsignale der einzelnen Substratproteine getrennt registriert werden mussten.

Ferner erlaubte sie hochempfindliche Messungen unter Einsatz geringster Probenvolumina. Trypsin gezeigt wurde. Das zweite Nachweisverfahren basiert auf mit einem Farbstoff und Biotin modifiziertem Substrat unter Verwendung streptavidinfunktionalisierter Oberflächen. Proteolytische Aktivität resultiert in diesem Fall in erhöhten Signalzahlen in der auf der Oberfläche befindlichen Probenlösung, da bei verdauten Substraten die farbstoffmarkierten Fragmente, im Gegensatz zu den biotinylierten, nicht an die Oberfläche binden.

Mit diesem Verfahren war die proteolytische Aktivität von 1 nM Trypsin bzw. Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 erzielten Ergebnisse belegen die Eignung des entwickelten Markierungsverfahrens und der darauf basierenden Nachweissysteme zur Anwendung in der Krebsforschung.

Insbesondere die geringen benötigten Probenmengen, die hohe Empfindlichkeit sowie der überschaubare präparative Aufwand qualifizieren die Methode zur Bestimmung der natürlichen Substrate tumorrelevanter Proteasen und zum Test möglicher Inhibitoren.

Beide Sonden Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 dahingehend optimiert, hochsensitiv und spezifisch DNA-Punktmutationen zu diskriminieren. SNP- Sensitivität Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 erforderlich, da Punktmutationen in vielen Fällen einen ersten Schritt auf dem Weg zur Krebsentstehung darstellen und direkt mit einem gesteigerten Krebsrisiko korrelieren. Weiterhin eignen sich SNPs als Biomarker zur Krebsfrüherkennung, wobei eine empfindliche und zugleich spezifische Erkennung wesentlich ist.

Dies sind DNAHaarnadelsonden, bei welchen die Fluoreszenzlöschung im geschlossenen Zustand auf Photoelektronentransfer zwischen Fluorophor und räumlich nahen Guaninen beruht. Durch Zugabe von nicht markierten sogenannten Konkurrenzoligonukleotiden KOswelche sich nur in der Position des SNPs von der Smart Probe unterscheiden, kann ein falsch-positiver Signalanstieg, hervorgerufen durch Doppelstrangausbildung zwischen Smart Probe und einer nicht exakt komplementären Basenabfolge, werden, da effektiv die unterdrückt Konkurrenzoligo- nukleotide diese Sequenzen binden Abbildung II.

Im Rahmen von Voruntersuchungen offenbarte der zu den 7-Aminocoumarinen zählende Farbstoff interessante Effekte. Emissionswellenlänge, Fluoreszenzquantenausbeute sowie Fluoreszenzlebensdauer änderten sich stark in Abhängigkeit der Solvenspolarität sowie der Mikroumgebung des Chromophors. Es zeigte sich, dass insbesondere beim Übergang von polar-aprotischen zu protischen Lösungsmitteln die Fluoreszenzquantenausbeute und -lebensdauer stark sinken. Darüber hinaus erbrachte die kovalente Anbindung des Farbstoffs an ein Oligonukleotid eine zehnfach höhere Fluoreszenzemission, welche durch Ausbildung IX eines DNA-Doppelstrangs unter bestimmten Voraussetzungen nochmals um das Fünffache anstieg.

Wie bereits bei den Smart Probes erfolgreich praktiziert, konnte auch in diesem Zusammenhang durch Zugabe von Konkurrenzoligonukleotiden eine punktmutationsspezische Diskriminierung mit einem Faktor von vier erreicht werden. Da die SNP-Diskriminierung der Sonde einzig auf der Anwesenheit der Konkurrenzoligonukleotide und nicht auf speziellen Sondensekundärstrukturen basiert, ermöglicht ein unkomplizierter Austausch der Konkurrenzoligonukleotid- oder der Sondensequenz den Nachweis eines anderen SNPs.

Es konnten damit fünf exemplarische, über die gesamte Sondenlänge verteilte Punktmutationen selektiv nachgewiesen werden, wobei der Diskriminierungsfaktor zwischen 3,2 und 4,5 betrug.

Eine Analyse basierend auf Signalquotienten erzeugt einen internen Standard und macht somit zusätzliche Vergleichsmessungen überflüssig. Darüber hinaus ist das System robust gegenüber differierender Laserleistungen oder schwankender Konzentrationen, was speziell im picomolaren Bereich oftmals nicht zu vermeiden ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit der DyXL-basierten DNA-Sonde eine weitere Möglichkeit verfügbar ist, Punktmutationen spezifisch und hochsensitiv nachzuweisen.

Sie zeichnet sich vor allem durch einen geringen Konzeptionsaufwand, als auch durch hohe Flexibilität im Hinblick auf Variation des zu erkennenden SNPs aus.

Die Fluoreszenzemissionscharakteristik des zu den Coumarinen gehörenden Farbstoffs macht die Verwendung eines fluoreszenzlöschenden Moleküls obsolet und den Nachweis somit kostengünstig. Dieses neuartige Sondensystem stellt Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 für die molekulare und medizinische Diagnostik ein effizientes und leistungsfähiges Instrument zu SNP-Analyse dar.

Laut Statistik starben hierzulande im Jahr über Aufgrund sich angleichender Raucherzahlen zwischen beiden Geschlechtern treten darauf zurückzuführende Malignome unter Frauen jedoch vermehrt auf.

Hanahan und Weinberg haben sechs grundlegende Ereignisse als Kriterien für Krebs aufgestellt [Hanahan ]. Krebs ist eine Krankheit, die sich durch unkontrollierte Zellteilung und gestörte Interaktion zwischen Tumor- und Nachbargewebe auszeichnet. Abbildung gibt einen Überblick über die verschiedenen Phasen der Tumorentstehung und -entwicklung. Der Prozess der Zellteilung ist in höheren Organismen strengt reguliert und jede Störung hat erhebliche Auswirkungen. In adulten Individuen sind Zellteilungen eher die Ausnahme als die Regel und finden nur in sehr genau definierten Regionen statt, beispielsweise in Schleimhäuten, der Keimschicht der Haut oder lokal und zeitlich begrenzt zur Wundheilung.

Die restlichen Zellen ruhen bedingt durch ein fein austariertes Signalnetzwerk in einem Zustand ohne Teilung 1. Zellen, die derartige Mutationen aufweisen, sind nicht automatisch Krebszellen, tragen jedoch ein deutlich erhöhtes Risiko, sich zu diesen zu entwickeln. Man bezeichnet sie als prämaligne Läsion 2, 3. Im weiteren Verlauf kommt es zur Ausbreitung in benachbartes Gewebe und zur Metastasierung 5 blaue Sterne. In Teil b der Abbildung sind die wichtigsten Stationen der Krebsentwicklung schematisch dargestellt.

In a sind angefärbte Gewebeschnitte verschiedener Krebsentwicklungsstadien abgebildet, Teil b zeigt den schematischen Ablauf der Brustkrebsentstehung über mehrere Stadien adaptiert aus [Vargo-Gogola ]. Ungeachtet der möglichen biochemischen Ereignisse, welche zu bösartigen Neubildungen führen, und der jeweiligen Krebsart, sind Primärtumore selten tödlich und meist durch chirurgischen Eingriff oder lokale Bestrahlung behandelbar [Lee ].

Dies ist ein komplexes strukturelles Netzwerk aus Proteinen und Kohlenhydraten, das die Zellen umgibt, ihnen zur Fortbewegung dient sowie dem Gewebe Halt und Struktur verschafft. Die Zell-ECMWechselwirkungen werden über spezielle Zelloberflächenrezeptoren gesteuert, welche die externen Reize in das Zellinnere weiterleiten und somit das Zellverhalten beeinflussen.

Damit bilden sie eine Barriere für invasive Tumorzellen. Sowohl zelloberflächengebundene, als auch intrazelluläre Matrixmetalloproteinasen MMPSerin- Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 Cysteinproteasen sowie Cathepsine, spalten und entfernen die unterschiedlichen ECM-Bestandteile, womit sie unter anderem matrixgebundene bioaktive Moleküle wie beispielsweise Wachstumsfaktoren freisetzen, welche ihrerseits die Tumorzellen beeinflussen [Lee ].

Zusätzlich ist seit vielen Jahren das Vorhandensein verschiedener Leukozyten bekannt [Balkwill ], deren Zusammensetzung je nach Tumorentwicklungsstufe und der speziellen Mikroumgebung variiert. Früher ging man davon aus, dass deren Anwesenheit auf gescheiterte Versuche des Immunsystems zur Krebszellzerstörung zurückzuführen sei.

Jedoch können unter dem Einfluss der Tumormikroumgebung ursprünglich krebsunterdrückende Entzündungszelltypen tumorfördernde Wirkung haben [Joyce ]. Das ist im speziellen bei Tumoren als Folge chronischer Entzündungen ersichtlich, wenn die Entzündungsreaktion nicht beendet wird. Deshalb kann eine chronische Entzündung eine Kettenreaktion in Gang setzen, welche die tumorfördernden Eigenschaften von Immunzellen, die diese aufgrund ihrer Reparatureigenschaften besitzen, verstärkt [Medzhitov ].

Unter anderem tragen sie durch Ausschüttung von Proteasen zur Krebsentwicklung bei [Hiratsuka ; van Kempen ]. Tumorinvasivität, Angiogenese und nicht zuletzt Metastasierung zu [Lee ], was in Studien einen direkten Zusammenhang zwischen erhöhter MMP-Expression und reduzierter Überlebensdauer ergab [Rao ]. Des Weiteren unterstützen sie die Angiogenese durch Erhöhung der Verfügbarkeit von proangiogenetischen Wachstumsfaktoren. Deshalb wurden Proteasen, vor allem MMPs, Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 in den neunziger Jahren des letzten Jahrhunderts als aussichtsreiche Ziele für die Krebstherapie erkoren.

Nach vielversprechenden Tierversuchen mit Breitbandinhibitoren verliefen die nachfolgenden klinischen Studien jedoch enttäuschend [Coussens ; Egeblad ; Turk ]. Zusätzlich zu erheblichen Nebenwirkungen wurde in machen Fällen ein krebsfördernder Einfluss der Inhibitoren vermutet [Overall ]. Abbildung Aktivierungskaskade einiger in die Tumormetastasierung involvierter proteolytischer Enzyme.

Bemerkenswert ist das komplexe Zusammenspiel im Aktivierungsprozess [Lee ]. Es stellte sich heraus, dass unterschiedliche Proteasen die Effekte in den jeweiligen Tumorentwicklungsstadien dominieren. Ferner fungieren sie als Auslöser von Signalkaskaden, die weitere tumorfördernde Mechanismen aktivieren.

Ebenfalls sind viele Transmembranproteasen an der Kommunikation zwischen Zellinnerem und extrazellurären Raum beteiligt. Für detaillierte und weitergehende Informationen sind zahlreiche sehr gute Übersichtsartikel zu diesem Themenkreis verfügbar, z. Hierzu ist Behandlung von Prostatakrebs Diagramm SDA 2 detailliertes Wissen über die einzelnen Funktionen der Proteasen erforderlich. Proteasen werden im extrazellulären Milieu als inaktive Proformen exprimiert, und erst durch verschiedene Mechanismen, an denen oft andere Proteasen beteiligt sind, aktiviert.

Aufgrund dessen eignen sich antikörperbasierte Verfahren nicht als Proteasenachweis, da sie nicht zwischen inaktiver Proform und aktiver Protease unterscheiden können [DeClerck ]. Eine erhöhte Expressionsrate, wie von immunohistochemischen Methoden belegt, ist daher nicht zwangsläufig gleichbedeutend mit einem Anstieg der proteolytischen Aktivität [Coussens ].

Es ist demnach erforderlich, direkt die Aktivität der Proteasen bestimmen zu können. Neben in vivo-Anwendung, welche mit optischen Verfahren diese bestimmten Tumorregionen zuordnen können [Mahmood ; Sameni ], ist es unerlässlich, die Proteasen in vitro separat zu charakterisieren [Lee ]. Die Verwendung von gelbasierten Methoden ist hierfür aufgrund ihres arbeitsaufwändigen und komplexen Charakters nicht empfehlenswert [Shelat ; Tatham ]. Fluoreszenzbasierte Nachweisverfahren zeichnen sich in jenem Zusammenhang durch ihre Robustheit und hohe Sensitivität, auch im Vergleich zu anderen Methoden, aus [Meldal ].

Dabei sind die Peptide mit Fluorophor und Löschmolekül in der Weise verknüpft, dass eine proteolytische Hydrolyse der Peptidkette zu einem Fluoreszenzanstieg führt [Carroll ; Cotrin ] Abbildung a. Derartige Untersuchungen geben Aufschluss über die von Proteasen jeweils erkannten Schneidesequenzen und können mit geeigneten Substraten zur Aktivitätsbestimmung herangezogen werden.